洋葱亚细胞定位培养-武汉思特进科技公司_武汉其它电感

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泛素-蛋白酶体通路在植物---反应(包括反应)中发挥重要作用，泛素连接酶(ubiquitin ligase， e3)则是参与这一过程的重要组分。本研究旨在通过和分析与马铃薯晚疫病抗性相关的泛素连接酶家族中的成员，初步揭示这类基因在马铃薯晚疫病垂直抗性和水平抗性中的调控作用，或它们在马铃薯防御晚疫病菌侵染的信号传导网络中的作用，为进一步深入开展抗性机理研究奠定基础。本实验室从晚疫病---的马铃薯水平抗性材料构建的cdna---中筛选出两个与avr9/cf-9 rapidly elicited protein (acre，具有泛素连接酶e3活性)基因有---同源性的est片段(10-a12和08-e12)。本研究中，我们了这两个est片段所代表的基因，strfp和stpub，并研究了其生物学功能。 strfp基因的全长cdna为1354 bp，包含一个789 bp的开放阅读框(orf)，编码262个---酸，含有高度保守的ring-h2型ring指结构域、跨膜结构域和gld结构域，是一个新的马铃薯atl (arabidopsis toxico para levadura)蛋白。strfp基因位于马铃薯第3条染色体上，不含内含子。马铃薯基因组中可能有1-2个strfp基因拷贝或与之同源性高的基因。利用洋葱表皮细胞进行的strfp-gfp融合蛋白亚细胞定位结果显示，strfp在细胞膜上或膜外表达。

重金属转运蛋白p-type atpase(hma)已被证实参与植物体内的重金属运输，hma5主要参与铜的转运。在模式植物拟南芥、水稻和黄瓜中对hma5基因进行了较多的研究，但是对豆科植物hma5的研究鲜见---。实验室前期在天蓝苜蓿中分离到一个与铜---及共生结瘤相关的hma5基因，为了对此类基因在豆科植物共生结瘤中的作用进行深入研究，本研究对全基因组已测序的模式豆科植物蒺藜苜蓿的基因组进行---，寻找hma5同源基因并通过表达模式分析初步判断其与共生结瘤的关系，在此基础上，以其中的mtr_8g079250基因为对象，进行亚细胞定位、组织表达、rna干扰和过量表达等研究，初步鉴定该基因在共生结瘤中的功能。1、mtr_8g079250的亚细胞定位构建mtr_8g079250的洋葱表皮亚细胞定位载体，通过基因枪轰击转化洋葱表皮细胞，在激光共---显微镜下观察到mtr_8g079250::gfp融合蛋白主要在细胞膜上表达，在细胞核上也有微量的表达；构建mtr_8g079250的叶片亚细胞定位载体，通过根癌农介导注射叶片的方式进行转化，结果表明目的基因主要定位在细胞膜和细胞核上；2、mtr_8g079250的组织表达构建pmtr_8g079250::gus融合表达载体，通过农发根转化的方式转入蒺藜苜蓿根部，经培养后，进行gus染色观察。

以苎麻优良品系5041-3子叶作为受体，洋葱亚细胞定位培养，利用根癌农介导法进行了绿色荧光蛋白基因的遗传转化研究，农菌株为eha105，重组质粒为pbinm-gfp5-er。经农浸染后的子叶外植体经过共培养、选择培养、伸长培养和生根培养后再生出抗性植株，对抗性植株的再生过程进行了gfp荧光检测，结果表明，gfp基因能在苎麻中---表达，证明gfp基因能够在苎麻遗传转化中得到应用。对抗性植株的southern杂交检测证实外源基因已整合到苎麻基因组中。

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